Оценка чувствительности инструментальных методов выявления антител

Как указывают многие исследователи, вновь создаваемые методы определе­ния антител должны быть по уровню чувствительности не ниже классической непрямой пробы Кумбса с использованием раствора низкой ионной силы (LISS) (Voak [679, 680], Bruce и соавт. [185], BCSH (Британский комитет по стандарти­зации в гематологии) [557], Poole и соавт. [533]).

Weisbach и соавт. [701] сравнили результаты определения антиэритроцитар-ных антител с помощью микрокапиллярных колонок и непрямой пробы Кумбса и нашли, что чувствительность микрокапиллярного метода в отношении кли­нически значимых антител несколько выше, чем непрямой реакции Кумбса. Однако авторы не могли выявить анти-Лс^а-антитела обоими сравниваемыми ме­тодами в 4 из 12 случаев.

Уместно подчеркнуть, что определение антител с помощью микрокапилляр­ных колонок включало инкубацию реагирующей смеси в течение 15 мин, а в не­прямой реакции Кумбса инкубация составляла 10 мин, что весьма существенно.

Fitzsimmons и Morel [287] установили, что увеличение времени инкубации реагирующей смеси повышает чувствительность непрямой реакции Кумбса. Дополнительные 5 мин инкубации могут быть решающими в выявлении бо­лее слабых антител.

Voak и соавт. [682] также привели данные о том, что продолжительность ин­кубации важна для выявления некоторых образцов слабых антител анти-1к^а, aHTH-Fy^b и анти-К при использовании 1,5-2% суспензии эритроцитов в раство­ре низкой ионной силы.

Bromilow и соавт. [183], Kretschmer и соавт. [399] считают, что тесты на ми­крокапиллярных колонках Dia Med (Швейцария) чувствительнее, но Voak и соавт. [681], Phillips и соавт. [524], Pinkerton и соавт. [527] отмечают, что этот тест не бо­лее чувствителен, чем хорошо выполненная непрямая проба Кумбса с LISS.

На наш взгляд, возможные причины того, что методы, основанные на ис­пользовании микрокапиллярных колонок, дают лучшие результаты, чем непря­мая проба Кумбса с LISS, могут заключаться, в следующем:

• микрокапиллярные гелевые технологии включают центрифугирование реагирующих ингредиентов непосредственно во время реакции, что су­щественно усиливает агглютинацию эритроцитов. Центрифугирование при выполнении непрямой пробы Кумбса используют только для отмыва­ния эритроцитов и это никак не сказывается на выраженности агглютина­ции. В то же время, если использовать центрифугирование на стадии вза­имодействия сенсибилизированных эритроцитов с антиглобулиновой сы­вороткой, то выраженность реакции можно существенно усилить;
• гелевые технологии имеют объективную, независимую от оператора, автоматизированную систему учета результатов, в то время как проби­рочные тесты, в том числе непрямая проба Кумбса с LISS, оценивают субъективно, и результат во многом зависит от навыков оператора. Имеются указания на то, что чрезмерное встряхивание реагирующей сме-и может искажать результаты. Исследования, проведенные в рамках совмест­ной программы «Международного комитета стандартов в гематологии» и «Международного общества переливания крови» показали, что чрезмерное встряхивание при ресуспендировании взвеси эритроцитов является причиной ложноотрицательных результатов (Holburn [352], Voak и соавт. [684]).

Причиной искажения результатов может быть также недостаточное отмыва­ние эритроцитов (Voak и соавт. [683]).

В 1981 г. Voak и соавт. [684] провели серию экспериментов для изучения проблем, связанных с отмыванием эритроцитов при постановке непрямой ан­тиглобулиновой реакции. Авторы исследовали эритроциты, сенсибилизиро­ванные слабыми aHTH-D-антителами IgG, реагирующими с авидностью от + до ++. Для отмывания эритроцитов применяли разные солевые растворы и различные режимы центрифугирования. Установлено, что даже при использо­вании хорошо зарекомендовавших себя отмывающих растворов регистрируют ложные результаты.

Применение слепого метода для оценки работы персонала подтвердило, что примерно 20 % кадровых сотрудников ошибались в 5 % случаев при использо­вании эритроцитов, сенсибилизированных aHTH-D-антителами IgG, которые ре­агировали, как указывалось выше, с авидностью от + до ++ (Voak и соавт. [683]).

Причиной ошибочных результатов при выполнении непрямой реакции Кумбса может служить примесь антикомплементарных антител в поликлональ-ных тестовых антиглобулиновых сыворотках. Чаще всего встречаются антитела к СЗ-компоненту комплемента. При инкубации свежей сыворотки, смешанной с эритроцитами, на последних может адсорбироваться комплемент, что создает видимость положительного результата.

Проблема специфичности поликлональных антиглобулиновых сывороток была в значительной мере решена, когда Международный комитет стандартов в гематологии [370] утвердил стандартные процедуры, необходимые для контро­ля примеси анти-СЗё-антител в этих тестовых реагентах.

С целью предупреждения ошибок при учете результатов непрямой ре­акции Кумбса в программу обучения специалистов службы крови Англии включен слепой тест на выявление слабых антител, позволяющий проводить быстрое обучение и коррекцию любых ошибок, сопровождающих скрининг антител. Этот тест может быть использован для оценки результатов рабо­ты каждого работника. С 1987 г. он рекомендован Британским комитетом по Щандартам в гематологии для специалистов-иммуносерологов госпиталь­ных банков крови [325].

В 1993 г. в Англии введен национальный референтный реагент анти-D IgG для контроля методов и мастерства операторов в отношении слабой, выявляе­мой нередко только под микроскопом агглютинации (Phillips и соавт. [523]).

Важным этапом в стандартизации методов выявления антиэритроцитарных антител и повышения их чувствительности явилось использование автоматиче­ских ридеров для плат (Poole и соавт. [533]), а также разработка гелевых мето­дов DiaMed (Швейцария), Auto Bio Vue (Англия), Scan Gel (Франция, США).

Гелевые методы весьма перспективны. По оценкам специалистов, набор обо­рудования для гелевого метода может заменить 3-4 работников, что в экономи­чески развитых странах покрывает расходы достаточно быстро. Однако исполь­зование такого оборудования, стоимостью 150-160 тыс. долларов США, в оте­чественной службе крови представляется в настоящее время нерентабельным, поскольку в сравнении с отечественными методами определения групповой и резус-принадлежности крови оно на порядок дороже. Кроме того, иммуносеро-логам хорошо известно, что ни одна из автоматизированных систем не может выявить все существующие антитела в их многообразии.

Например, Cummins и соавт. [240] нашли, что гелевые методы DiaMed, Auto Bio Vue в ряде случаев не выявляют слабую несовместимость по системе АВО, которую выявляет простая пробирочная проба. Гелевые тесты в ряде случаев не выявляют слабые антитела aHra-Fy^a, анти-Лс^а, анти-S, анти-К (Voak и соавт. [681], Phillips и соавт.                                                                                 

Причиной этого является все то же центрифугирование, которое разрыва­ет слабые агтлютинаты в процессе принудительного продавливания их через плотный гель. При исследовании 100 образцов плазмы группы В(Ш) с эрит­роцитами A₂B(IV) гелевым тестом DiaMed не выявлено 68 случаев несов­местимости, тестом Auto Bio Vue - 76 случаев, а 5-минутный пробирочный тест с 0,9% NaCl -8 случаев (Phillips и соавт. [522]).

Важным компонентом при определении антител наряду с методикой являют­ся используемые стандартные эритроциты. Результативность скрининга во мно­гом зависит от качества эритроцитов, присутствия в них тех или иных антигенов.

Какие эритроциты рекомендуется использовать для скрининга антител? В ответе на этот вопрос нет единого мнения. Для повседневного скрининга ан­тител используют одно-, двух- и трехклеточные панели стандартных эритроци­тов, содержащие максимальное количество трансфузионно опасных антигенов: D, С, Е, с, е, К, k, Fy^a, Jk^a, М, N, S, s, Le^a, Lu^a и др.

Для идентификации антиэритроцитарных антител используют многоклеточные панели, включающие C^w и Кр^а (Penny) и др., в том числе редкие антигены в гомо-и гетерозиготном варианте. Такие панели требуют лаборатории с большим набором реагентов, хранилищем жидкого азота (Voak и Scott [685]). Некоторые исследователи полагают, что в высокочувствительных методах (СканГель, DiaMed и др.) можно ис­пользовать пулированные эритроциты, полученные смешиванием нескольких гомо­зиготных образцов. Так, Lillevang и соавт. [442] считают, что смесь из двух образцов эритроцитов не менее надежна в серологических реакциях, чем те же образцы Эри­троцитов, взятые раздельно. Смесь должна содержать эритроциты двух доноров, каждый из которых гомозиготен по разным трансфузионно опасным антигенам.