Напишите нам

Поиск по сайту

Наш блог

Как я заболел во время локдауна?

Это странная ситуация: вы соблюдали все меры предосторожности COVID-19 (вы почти все время дома), но, тем не менее, вы каким-то образом простудились. Вы можете задаться...

5 причин обратить внимание на средиземноморскую диету

Как диетолог, я вижу, что многие причудливые диеты приходят в нашу жизнь и быстро исчезают из нее. Многие из них это скорее наказание, чем способ питаться правильно и влиять на...

7 Фактов об овсе, которые могут вас удивить

Овес-это натуральное цельное зерно, богатое своего рода растворимой клетчаткой, которая может помочь вывести “плохой” низкий уровень холестерина ЛПНП из вашего организма....

В какое время дня лучше всего принимать витамины?

Если вы принимаете витаминные и минеральные добавки в надежде укрепить свое здоровье, вы можете задаться вопросом: “Есть ли лучшее время дня для приема витаминов?”

Ключ к счастливому партнерству

Ты хочешь жить долго и счастливо. Возможно, ты мечтал об этом с детства. Хотя никакие реальные отношения не могут сравниться со сказочными фильмами, многие люди наслаждаются...

Как получить сильные, подтянутые ноги без приседаний и выпадов

Приседания и выпады-типичные упражнения для укрепления мышц нижней части тела. Хотя они чрезвычайно распространены, они не могут быть безопасным вариантом для всех. Некоторые...

Создана программа предсказывающая смерть человека с точностью 90%Смерть научились предсказывать

Ученые из Стэнфордского университета разработали программу предсказывающую смерть человека с высокой точностью.

Зарплата врачей в 2018 году превысит средний доход россиян в два разаЗП докторов

Глава Минздрава РФ Вероника Скворцова опровергла сообщение о падении доходов медицинских работников в ближайшие годы. Она заявила об этом на встрече с журналистами ведущих...

Местная анестезия развивает кардиотоксичностьАнестетики вызывают остановку сердца

Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения озвучила тревожную статистику. Она касаются увеличения риска острой кардиотоксичности и роста сопутствующих осложнений от...

Закон о праве родителей находиться с детьми в реанимации внесен в ГосдумуРебенок в палате

Соответствующий законопроект внесен в палату на рассмотрение. Суть его заключается в нахождении одного из родителей в больничной палате бесплатно, в течении всего срока лечения...


Идентификация резус-принадлежности по ДНК более сложная процедура, чем ДНК-типирование групповых антигенов АВО, Lewis и др. Это можно объ­яснить тем, что большинство антигенных систем эритроцитов человека кодиру­ется простыми, часто одиночными нуклеотидными заменами, встречающимися с большим постоянством. Различия антигенов Rh обусловлены множественны­ми нуклеотидными заменами и сложными перестройками в генах RHD и RHCE, поэтому, несмотря на высокую степень гомологии этих генов, трудно найти для амплификации соответствующие участки, которые отличались бы друг от друга с достаточным постоянством.

Наиболее контрастные отличительные признаки генов D и СЕ отмечены в 3!-концевом участке экзона 7 [441, 721], интроне 4 [138, 194, 615, 616], экзонах 3-7 и 9 [298,381,420,452].

Определение резус-принадлежности индивида по его ДНК сводится к уста­новлению последовательности аминокислот в указанных выше участках генов RH с помощью ПЦР. Сравнивая результаты ПЦР, полученные с испытуемым образцом ДНК и контрольными образцами, можно сделать заключение о том,

какому типу (D+ или 0§§ соответствует аминокислотная последовательность исследуемого субстрата.

Генотип, определяемый по ДНК, не всегда совпадает с серологически выяв­ляемым фенотипом. Так, Du или парциальный D-антиген, диагностированный с помощью ПЦР, может не соответствовать результатам серологических исследова­ний, в которых они проявляют себя как обычный D. Нередко ПЦР выявляет фраг­менты гена D у лиц D-, на основании чего делают вывод, что данные лица гене­тически являются резус-положительными, но имеют неэкспрессирующий ген Д вследствие чего серологически их идентифицируют как резус-отрицательные.

Avent и соавт. [146], Rouillac и соавт. [582] указывают, что более точные ре­зультаты удается получить с помощью двух ПЦР, направленных к разным участ­кам гена. Еще более точные результаты получили Gassener и соавт. [298], Legler и соавт. [420], Maaskant-van Wijk и соавт. [452] при использовании комплексной ПЦР, фокусированной на несколько экзонов, например: 3-7,9.

Bennet и соавт. [162] выявили с помощью соответствующих олигонуклеотид-ных праймеров продукт из 186 пн от З'-концевого некодирующего участка экзо­на 10 гена Д в то время как ген СЕ не давал продукта от этого участка экзона 10.

Volter и соавт. [721] предложили метод, основанный на установлении разли­чий, имеющихся в экзоне 7 генов D и СЕ. Авторы сравнили продукт из 155 пн гена D и 146 пн гена СЕ. Применяя этот метод с соответствующими контролями, можно определить, является ли человек гетеро- или гомозиготным по гену D.

Метод, предложенный Simsek и соавт. [615], включает амплификацию нитро­на 4 генов D и СЕ. Продукт ПЦР, полученный от гена СЕ9 составляет 1200 пн, а продукт гена D - 600 пн, так как интрон 4 гена D имеет делецию 650 пн.

Когда эти различные методы были опробованы на большом числе образцов ДНК, полученных от людей с известным фенотипом D, стало очевидно, что не все люди D- имеют делецию гена D.

Simsek и соавт. [615] выявили 3 человека с фенотипом Cde, которые типирова-ны как D+, и 2 человека с фенотипом CcDe, типированных как D-. Авторы иден­тифицировали ген D по экзону 10, что дало несовпадающие результаты. Многие исследователи признают, что такие расхождения при использовании ПЦР встре­чаются, и что типирование антигена D по ДНК должно производиться как мини­мум двумя различными тестами и по разным районам гена D [146,441,616].

Hyland и соавт. [368] сообщили о 2 донорах с фенотипом Cde, один из кото­рых имел фрагменты гена Д присутствующие выше 5!-участка экзона 1 и вну­три З'-некодирующего участка. Последовательности гена Д обычно располо­женные между экзонами 7 и 10, у этого донора отсутствовали. У другого донора был нормальный ген D в обследованных участках.

Blunt и соавт. [174], Carritt и соавт. [194] обнаружили у 8 неродственных до­норов негров с фенотипом Cdes делецию гена Д однако экзоны 8-10 присут­ствовали. В методе идентификации гена D с помощью ПЦР по экзону 10 такие индивидь! типируются как D+.

Carritt и соавт. [194] обратили внимание на высокую частоту лиц монголо­идной расы, которые имели нормальный ген D, но настолько слабый антиген D, что его можно было выявить только с помощью адсорбции - элюцииЛ

Qun и соавт. [541] исследовали ДНК 74 резус-отрицательных китайцев на­родности хан. У 46 из них специфические для гена D экзоны отсутствовали. У 22 обнаружена мутация G 1227 А, характерная для фенотипа Del. У 5 человек имелся гибридный ген RHD(l-2)-CE(3-9)-D(10). Один исследованный имел эк-зон 6 гена RHD с необычной мутацией С 93 А. Авторы выделяют 3 возможные, по их мнению, механизма, приводящие к формированию резус-отрицательного фенотипа: делеция гена RHD, гибридный ген RHD-CE-D и мутация С 93 А. Причем 2 последних механизма вносят определенные разногласия в результаты гено- и фенотипирования. При генотипировании обследуемый человек иденти­фицируется как D+, а при фенотипировании - как D-.

Аллель-специфическая ПЦР разработана для генотипирования антигенов hr' (с) и rh" (Е) [417], rh" (Е) и hr" (е) [280], D, С и с [536], а также для установ­ления гомо- и гетерозиготности индивида по генам RH [519].

Определенные успехи достигнуты в идентификации антигена D на ранних стадиях развития эмбриона по ДНК, экстрагированной из амниоцитов, присут­ствующих в амниотической жидкости.

Следует отметить, что из-за сложности ДНК-типирования антигена D мето­ды молекулярной диагностики, включая полимеразную цепную реакцию, ред­ко применяют взамен серологического типирования. Исключение составляют случаи судебно-медицинских экспертиз, имеющих целью установить или ис­ключить родственные отношения между обследуемыми. В этих случаях ДНК-типирование, в том числе по системе резус, практически не дает сбоев.

С целью проверки достоверности результатов определения групповой принадлежности крови молекулярно-биологическими методами проведено I Международное рабочее совещание по генотипированию групп крови в рам­ках Международного общества трансфузиологов и Международного комитета по стандартизации в гематологии.

ЦРабота сводилась к следующему: в 30 профильных лабораторий направлены контрольные образцы ДНК взрослых людей и новорожденных с закодирован­ным фенотипом. Как следует из отчетного доклада, представленного Daniels и соавт. [249], после сравнения полученных результатов выяснилось, что ошибки идентификации молекулярными методами составили от 0 до 11 %. С тем, что­бы предупредить возможные ошибки, рабочее совещание решено проводить раз в два года.

Как указывают многие исследователи, вновь создаваемые методы определе­ния антител должны быть по уровню чувствительности не ниже классической непрямой пробы Кумбса с использованием раствора низкой ионной силы (LISS) (Voak [679, 680], Bruce и соавт. [185], BCSH (Британский комитет по стандарти­зации в гематологии) [557], Poole и соавт. [533]).

Weisbach и соавт. [701] сравнили результаты определения антиэритроцитар-ных антител с помощью микрокапиллярных колонок и непрямой пробы Кумбса и нашли, что чувствительность микрокапиллярного метода в отношении кли­нически значимых антител несколько выше, чем непрямой реакции Кумбса. Однако авторы не могли выявить анти-Лса-антитела обоими сравниваемыми ме­тодами в 4 из 12 случаев.

Уместно подчеркнуть, что определение антител с помощью микрокапилляр­ных колонок включало инкубацию реагирующей смеси в течение 15 мин, а в не­прямой реакции Кумбса инкубация составляла 10 мин, что весьма существенно.

Fitzsimmons и Morel [287] установили, что увеличение времени инкубации реагирующей смеси повышает чувствительность непрямой реакции Кумбса. Дополнительные 5 мин инкубации могут быть решающими в выявлении бо­лее слабых антител.

Voak и соавт. [682] также привели данные о том, что продолжительность ин­кубации важна для выявления некоторых образцов слабых антител анти-1ка, aHTH-Fyb и анти-К при использовании 1,5-2% суспензии эритроцитов в раство­ре низкой ионной силы.

Bromilow и соавт. [183], Kretschmer и соавт. [399] считают, что тесты на ми­крокапиллярных колонках Dia Med (Швейцария) чувствительнее, но Voak и соавт. [681], Phillips и соавт. [524], Pinkerton и соавт. [527] отмечают, что этот тест не бо­лее чувствителен, чем хорошо выполненная непрямая проба Кумбса с LISS.

На наш взгляд, возможные причины того, что методы, основанные на ис­пользовании микрокапиллярных колонок, дают лучшие результаты, чем непря­мая проба Кумбса с LISS, могут заключаться, в следующем:

  • микрокапиллярные гелевые технологии включают центрифугирование реагирующих ингредиентов непосредственно во время реакции, что су­щественно усиливает агглютинацию эритроцитов. Центрифугирование при выполнении непрямой пробы Кумбса используют только для отмыва­ния эритроцитов и это никак не сказывается на выраженности агглютина­ции. В то же время, если использовать центрифугирование на стадии вза­имодействия сенсибилизированных эритроцитов с антиглобулиновой сы­вороткой, то выраженность реакции можно существенно усилить;
  • гелевые технологии имеют объективную, независимую от оператора, автоматизированную систему учета результатов, в то время как проби­рочные тесты, в том числе непрямая проба Кумбса с LISS, оценивают субъективно, и результат во многом зависит от навыков оператора. Имеются указания на то, что чрезмерное встряхивание реагирующей сме-и может искажать результаты. Исследования, проведенные в рамках совмест­ной программы «Международного комитета стандартов в гематологии» и «Международного общества переливания крови» показали, что чрезмерное встряхивание при ресуспендировании взвеси эритроцитов является причиной ложноотрицательных результатов (Holburn [352], Voak и соавт. [684]).

Причиной искажения результатов может быть также недостаточное отмыва­ние эритроцитов (Voak и соавт. [683]).

В 1981 г. Voak и соавт. [684] провели серию экспериментов для изучения проблем, связанных с отмыванием эритроцитов при постановке непрямой ан­тиглобулиновой реакции. Авторы исследовали эритроциты, сенсибилизиро­ванные слабыми aHTH-D-антителами IgG, реагирующими с авидностью от + до ++. Для отмывания эритроцитов применяли разные солевые растворы и различные режимы центрифугирования. Установлено, что даже при использо­вании хорошо зарекомендовавших себя отмывающих растворов регистрируют ложные результаты.

Применение слепого метода для оценки работы персонала подтвердило, что примерно 20 % кадровых сотрудников ошибались в 5 % случаев при использо­вании эритроцитов, сенсибилизированных aHTH-D-антителами IgG, которые ре­агировали, как указывалось выше, с авидностью от + до ++ (Voak и соавт. [683]).

Причиной ошибочных результатов при выполнении непрямой реакции Кумбса может служить примесь антикомплементарных антител в поликлональ-ных тестовых антиглобулиновых сыворотках. Чаще всего встречаются антитела к СЗ-компоненту комплемента. При инкубации свежей сыворотки, смешанной с эритроцитами, на последних может адсорбироваться комплемент, что создает видимость положительного результата.

Проблема специфичности поликлональных антиглобулиновых сывороток была в значительной мере решена, когда Международный комитет стандартов в гематологии [370] утвердил стандартные процедуры, необходимые для контро­ля примеси анти-СЗё-антител в этих тестовых реагентах.

С целью предупреждения ошибок при учете результатов непрямой ре­акции Кумбса в программу обучения специалистов службы крови Англии включен слепой тест на выявление слабых антител, позволяющий проводить быстрое обучение и коррекцию любых ошибок, сопровождающих скрининг антител. Этот тест может быть использован для оценки результатов рабо­ты каждого работника. С 1987 г. он рекомендован Британским комитетом по Щандартам в гематологии для специалистов-иммуносерологов госпиталь­ных банков крови [325].

В 1993 г. в Англии введен национальный референтный реагент анти-D IgG для контроля методов и мастерства операторов в отношении слабой, выявляе­мой нередко только под микроскопом агглютинации (Phillips и соавт. [523]).

Важным этапом в стандартизации методов выявления антиэритроцитарных антител и повышения их чувствительности явилось использование автоматиче­ских ридеров для плат (Poole и соавт. [533]), а также разработка гелевых мето­дов DiaMed (Швейцария), Auto Bio Vue (Англия), Scan Gel (Франция, США).

Гелевые методы весьма перспективны. По оценкам специалистов, набор обо­рудования для гелевого метода может заменить 3-4 работников, что в экономи­чески развитых странах покрывает расходы достаточно быстро. Однако исполь­зование такого оборудования, стоимостью 150-160 тыс. долларов США, в оте­чественной службе крови представляется в настоящее время нерентабельным, поскольку в сравнении с отечественными методами определения групповой и резус-принадлежности крови оно на порядок дороже. Кроме того, иммуносеро-логам хорошо известно, что ни одна из автоматизированных систем не может выявить все существующие антитела в их многообразии.

Например, Cummins и соавт. [240] нашли, что гелевые методы DiaMed, Auto Bio Vue в ряде случаев не выявляют слабую несовместимость по системе АВО, которую выявляет простая пробирочная проба. Гелевые тесты в ряде случаев не выявляют слабые антитела aHra-Fya, анти-Лса, анти-S, анти-К (Voak и соавт. [681], Phillips и соавт.                                                                                 

Причиной этого является все то же центрифугирование, которое разрыва­ет слабые агтлютинаты в процессе принудительного продавливания их через плотный гель. При исследовании 100 образцов плазмы группы В(Ш) с эрит­роцитами A2B(IV) гелевым тестом DiaMed не выявлено 68 случаев несов­местимости, тестом Auto Bio Vue - 76 случаев, а 5-минутный пробирочный тест с 0,9% NaCl -8 случаев (Phillips и соавт. [522]).

Важным компонентом при определении антител наряду с методикой являют­ся используемые стандартные эритроциты. Результативность скрининга во мно­гом зависит от качества эритроцитов, присутствия в них тех или иных антигенов.

Какие эритроциты рекомендуется использовать для скрининга антител? В ответе на этот вопрос нет единого мнения. Для повседневного скрининга ан­тител используют одно-, двух- и трехклеточные панели стандартных эритроци­тов, содержащие максимальное количество трансфузионно опасных антигенов: D, С, Е, с, е, К, k, Fya, Jka, М, N, S, s, Lea, Lua и др.

Для идентификации антиэритроцитарных антител используют многоклеточные панели, включающие Cw и Кра (Penny) и др., в том числе редкие антигены в гомо-и гетерозиготном варианте. Такие панели требуют лаборатории с большим набором реагентов, хранилищем жидкого азота (Voak и Scott [685]). Некоторые исследователи полагают, что в высокочувствительных методах (СканГель, DiaMed и др.) можно ис­пользовать пулированные эритроциты, полученные смешиванием нескольких гомо­зиготных образцов. Так, Lillevang и соавт. [442] считают, что смесь из двух образцов эритроцитов не менее надежна в серологических реакциях, чем те же образцы Эри­троцитов, взятые раздельно. Смесь должна содержать эритроциты двух доноров, каждый из которых гомозиготен по разным трансфузионно опасным антигенам.

Eggington и соавт. [270] считают, что применение пулов эритроцитов снижает чувствительность метода, затрудняет интерпретацию результатов, уменьшает процент выявления антител. К такому же выводу пришли Bombail-Girard и соавт [177], Phillips                                                                                                                      

Возможность создания принципиально отличающейся системы, не связан­ной с прямым выявлением агглютинации эритроцитов, обсуждается в работе Narayanan и соавт. [503]. Авторы предложили новый способ учета реакции аг­глютинации в обычном и ультрафиолетовом свете. Эта система получила поло­жительную оценку Министерства здравоохранения США (Poole и соавт. [533]).

Метод дает возможность объективно оценить результаты непрямой реакции Кумбса, однако ряд технических особенностей не позволяет использовать его в конвейерной работе.

Предложены 6 приемов оценки иммуносерологических методов (Voak [679], Poole и соавт. [533]).

  1. Тест на чувствительность, при котором применяют заведомо слабые анти­тела. Применение сильных антител сглаживает картину, так как они имеют вы­сокую авидность, поэтому их легко обнаруживают даже в больших разведениях.
  2. Тест на юспроизводимость метода с использованием гетерозиготных образцов эритроцитов, сенсибилизированных слабыми референтным aHra-D-антителами IgG.
  3. Титрование антител, относящихся к разным антигенным системам эритро­цитов: анти-К, анти-Руа, анти-Jk3 и др. - для установления уровня чувствитель­ности в отношении антигенов каждой системы.
  4. Пробный подбор совместимых пар донор - реципиент с применением све­жих образцов сыворотки и эритроцитов. Такой подбор позволяет выявить лож-ноположительные результаты, обусловленные комплементом исследуемой сы­воротки и антикомплементарными антителами, в основном анти-СЗё, присут­ствующими в тестовых антиглобулиновых реагентах.
  5. Сравнительные испытания (не менее 3000 тестов) в разных лечебных учреждениях. Такие испытания хорошо выявляют недостатки и слабости лю­бых тестовых систем, обладающих разной степенью чувствительности к тем или иным антигенам и антителам.
  6. Тесты с гомо- и гетерозиготной формой различных антигенов для отобра методики, которая будет хорошо работать с гетерозиготными эритроцитами. Например, микроплатовые системы Solid Screen (Biotest) и Capture (Immuno) не требуют использования эритроцитов, гомозиготных по данным антигенам, и лучше выявляют слабые антитела, чем системы микрокапиллярных гелевых ко­лонок или классическая непрямая проба Кумбса (Poole и соавт. [533]).

Однако дальнейшие исследования показали, что примерно 50 % образцов эритроцитов Kk низкоавидны при выявлении антител Келл-Челлано. Это дает основание беспокоиться о качестве скрининга антител, так как невозможно обеспечить гомозиготными по антигену К эритроцитами все панели для скрининга антител из-за относительной редкости гомозигот КК: 2-3 образца на 1 тыс. (Phillips, Voak [521]).  щ

В литературе имеются сведения о создании иммуносерологических методов нового поколения, основанных на использовании антигенов эритроцитов, выде­ленных в чистом виде. Возможно, самая лучшая система, которая будет разра­ботана в ближайшем обозримом будущем, позволит проводить скрининг анти­тел с помощью биологического микрочипа, на который нанесены все известные трансфузионно опасные антигены. Над созданием подобных методов работает несколько групп ученых: одна - под руководством М. Scott в Международной референс-лаборатории групп крови (Бристоль, Англия), другая - под руковод-ством М. Read в Центре крови Нью-Йорка. Не исключено, что уже в ближай­шие годы мы можем стать свидетелями новых автоматизированных иммуно-ферментных методов определения клинически наиболее значимых эритроци-тарных антител без использования эритроцитов (Ekins [271], Ekins, Chu [272]). Попытки создания биочипов предпринимаются и в нашей стране.

Проанализированные нами данные литературы убеждают в том, что, несмо­тря на большой выбор автоматизированных методик, наилучшей до настоящего времени остается непрямая проба Кумбса.

По нашему мнению, упомянутое выше малогабаритное оборудова­ние Н.И. Васильева, специально предназначенное для проведения этой пробы, позволяет обеспечить высокое качество подбора совместимой крови для пере­ливания реципиенту.

История инструментальных автоматизированных методов иммуносерологического исследования начинает свой отсчет с 1960-х годов.

В 1963 г. в США McNeil и соавт. [473] предложили для определения группы крови анализатор «Техникой», применявшийся для биохимических исследова­ний. В основу прибора положен принцип движущихся порций эритроцитов, от­деленных друг от друга воздушной перемычкой, по спирально извитым пласти­ковым трубкам, в которые подают тестовые стандартные сыворотки. Длина тру­бок и скорость проталкивания образцов были рассчитаны таким образом, чтобы тестовые сыворотки успевали прореагировать с антигенами исследуемых эри-троцитов. Результаты учитывали фотометрическим методом: измерением раз­ности светопоглощения реагирующей смеси до и после реакции.

Анализатор McNeil представлял собой одноканальный прибор, что не позво­ляло проводить несколько исследований параллельно.

Для повышения чувствительности анализатора Sturgeon и соавт. [641] предложили предварительную обработку эритроцитов протеолитическими ферментами растительного происхождения. Наиболее эффективным для этих целей оказался бромелин - фермент, выделяемый из млечного сока стеблей ананасов.                                                                                                                                                                                                                                                 

Далее Sturgeon и соавт. [643] применили многоканальные варианты прибо-ра, анализирующие образец крови одновременно по нескольким параметрам, что существенно расширило возможности анализатора и его пропускную спо­собность. Авторы сконструировали 8-канальный прибор, определяющий груп­пу крови АВО и резус.

Затем были сконструированы 10-15-канальные системы (Peoples и соавт. [518], Moore, Fernandes и соавт. [478]), что позволило автоматизировать не только определение антигенов эритроцитов АВО и резус, но и проводить реакции на сифилис (Shoeter и соавт. [610]) и австралийский антиген (Berkman и соавт. [166], Moore, Fernandes [478]).

Широкое применение нашел БМЦ-тест (бромелинметилцеллюлозный), который повысил чувствительность приборов при выявлении антител Rh-Hr, Lewis, Kell, Daffy.

Заметным прогрессом в развитии автоматизированных методов серологи­ческого исследования явилась предложенная Lalezari [407] методика с исполь­зованием полибрена, с помощью которой выявляли антигены и антитела си­стемы Daffy, Kell, Kidd, MNSs в тех случаях, когда ферментная техника оказы­валась неэффективной.

Протеолитические ферменты существенно активируют реакцию связывания ан­тигенов и антител системы резус, однако, по мнению некоторых авторов, разруша­ют антигены Kell, Daffy (Nevaulinna, Pircola [505], A.A. Рагимов, Н.Г. Дашкова [92]).

Habibi и соавт. [332] применили одновременно несколько ферментных те­стов: ПМЦ-тест (папаинметилцеллюлозный), ТМЦ-тест (трипсинметилцел-люлозный) и полибреновый тест, что дало возможность проводить скрининг антител различного характера с максимально широкой специфичностью, улав­ливать те разновидности антител, которые выявляют исключительно каким-либо одним методом.

Более того, была автоматизирована антиглобулиновая проба Кумбса (Valeri и соавт. [675]), что создало предпосылки для внедрения оборудования, предназна­ченного для повседневного автоматизированного скрининга антител различной специфичности (Cotton, Ray [239], Moore [477]), в том числе аутоантител, фик­сированных на эритроцитах (Gorska и соавт. [310]), а также послужило основой автоматизации пробы на индивидуальную совместимость донора и реципиента при переливании эритроцитов (Wattar и соавт. [699]).

Rowe и соавт. [586] предложили полностью автоматизированную многоканальную систему «Техникой М-16» с микропроцессорным оснащением для интерпретации результатов серологических реакций и ввели в систему сканирующее лазерное устройство, идентифицирующее исследуемые образцы крови по бар-коду. Впервые бар-код в анализаторах групп крови был применен во французских приборах «Групаматик».

Одновременно с созданием в США анализаторов групп крови «Техникой» во Франции с 1963 по 1969 год под руководством Matte [465] была разработа­на принципиально отличающаяся автоматизированная система «Групаматик» (Groupamatic-50, -250, -360 соответственно на 50,250,360 определений в 1ч).

В отличие от аппаратов «Техникой» в приборах «Групаматик» был применен ком­пьютер, что обеспечило автоматическую интерпретацию результатов и вывод их на печать. Наиболее производительный вариант прибора представлял собой 12-каналь-ную систему, рассчитанную на исследование 360 образцов крови в 1 ч (Soulier [621]).

Другое немаловажное отличие системы «Групаматик» от системы «Техникой» заключалось в способе учета результатов серологических реакций. Визуальный учет результатов в автомате был заменен оптическим способом ре­гистрации: фотометрией жидкой части смеси и осадка (Unger, Ramgren [672]).

В приборах «Групаматик» для повышения чувствительности реакции было применено центрифугирование реагирующей смеси с последующим ресуспен-дированием посредством встряхивания. Это важная деталь в проведении имму-носерологических реакций.

Весьма существенным также было то, что выдачу ошибочных результатов (не укладывающихся в закономерности групповой дифференцировки крови людей) прибор блокировал.

Последующее техническое усовершенствование автоматов «Групаматик» по­зволило увеличить объем исследований, выполняемых при апробации донор­ской крови, а именно: ввести исследование сыворотки крови доноров на си­филис, гепатит, а также идентифицировать дозы крови при их выдаче потреби­телю, что при обычном, не автоматизированном, выполнении этой процедуры было источником ошибок (Р.А. Авдеева, Л.П. Лаврова [5]).

В аппаратах «Групаматик» успешно применяются те же методы, что и в аппаратах «Техникой»: бромелинметилцеллюлозная техника (Garetta и соавт. [297]), трипсин-полибренцитратная техника (Confida и соавт. [235]), антигаобулиновый метод (Matte [466]), реакция конглютинации в коллоидных средах (Habibi и соавт. [333]). Базовой серологической методикой приборов «Групаматик» является бромелиновая техника, обеспечивающая оптимальное определение наиболее значимых факторов в клиниче­ской трансфузиологии - группы крови АВО и резус-принадлежности (Haahty [330], O.K. Гаврилов и др. [25], Р.А. Авдеева и др. [4,5], Л.П. Лаврова и др. [73,74]).

Приборы «Групаматик» нашли применение в США, Англии, Японии, Швеции, Австрии. По своим техническим характеристикам - пропускной спо­собности, чувствительности реакций, надежности получаемых результатов -они выгодно отличались от других автоматов (Soustelle и соавт. [623]).

Известны модификации приборов для определения групп крови: «мини-Групаматик» (Reviel, Emblin [562]) и варианты прибора «Техникой» (Severns и соавт. [603]), позволяющие выполнять реакцию в микроплатах, что существен­но сокращает расход реагентов (Descamps и соавт. [260]).

Обращает на себя внимание предложенный в 1986 г. метод агглютинации в геле [261], который представляет собой комбинацию двух методов: агглютина­ции и гель-фильтрации*.

Попытки создания автоматических анализаторов групп крови были предпри­няты и в нашей стране. В 1990 г. в Гематологическом научном центре Российский Академии медицинских наук совместно с научно-исследовательским и конструк­торским институтом медицинской лабораторной техники Минмедпрома СССР был разработан и успешно прошел лабораторные испытания первый отечествен­ный анализатор групп крови - АГК-01 (А.Н. Алипов и др. [7], Р.С. Каландаров [63]). Прибор представлял собой полуавтоматическую систему, в которой были автоматизированы отдельные этапы реакции: разведение пробы, перемешивание

Метод подробно описан в книге А.А. Рагимова и Н.Г. Дашковой: «Основы трансфузион-ной иммунологии» [91].

нгредиентов реакции (эритроцитов и сывороток), центрифугирование смеси, учет результатов реакции, вывод результатов на печать. Производительность при­бора - 48 образцов крови в час.

По нашему мнению, реакция агглютинации эритроцитов как специфический фе­номен - быстропротекающий процесс, имеющий сложные био-физико-химические составляющие. Этот взгляд нашел подтверждение в работах Р.С. Каландарова [63], а также других авторов (Wardlaw и соавт. [698], B.C. Андреев [8]).

Поиск новых физических принципов оценки реакции агтлютинации представляет чрезвычайный интерес для теории и практики иммуносерологических исследований.

В последние годы получены интересные данные о своеобразном действии ультразвука на взвесь корпускулярных частиц (Н.Н. Князьков [65]). Ультразвук нарушает суспензионную стабильность эритроцитов и приводит к их быстрому оседанию (СИ. Донсков и др. [43], Р.С. Каландаров и др. [63,64]).

В течение нескольких секунд после подачи ультразвука взвесь эритроцитов расслаивается, образуются видимые агрегаты эритроцитов, которые после от­ключения ультразвука начинают быстро оседать на дно пробирки. Как отмеча­ют Н.Н. Князьков [65] и Р.С. Каландаров [63], ультразвук может найти примене­ние в анализаторах серологических реакций нового поколения.

В последние годы Narayanan и соавт. [503] разработали новую технологию типирования крови, основанную на спектроскопии в видимой и ультрафиолето­вой части спектра. Группу крови определяют по изменению оптической плотно­сти взвеси эритроцитов в присутствии агглютинирующих антител. Оптическая плотность ниже 665 нм соответствует отрицательному результату, выше 1000 нм - положительному. С помощью этого метода удалось с достаточно вы­сокой степенью совпадения определять группу крови и резус-принадлежность.

Несмотря на очевидные успехи в развитии автоматизированных серологических методов исследования, возможности их совершенствования далеко не исчерпаны.

Идеология конструирования анализаторов серологических реакций пер­вого поколения (приборы «Техникой», «Групаматик», «Контифло») бази­ровалась на принципе полной автоматизации без участия оператора, что­бы исключить ошибки, связанные с так называемым человеческим факто­ром. Процесс определения, согласно этой идеологии, должен быть поточным (конвейерным) и по возможности универсальным, пригодным для определе­ния максимального спектра антигенов и антител, отличающихся своими се­рологическими и физико-химическими характеристиками. Такое оборудова­ние предназначалось для крупных банков крови, имеющих огромную произ­водительность. Однако за всем этим не усматривались потребности неболь­ших, но наиболее многочисленных, особенно для Российской Федерации, структуру- отделений и кабинетов переливания крови. Их в Российской Федерации насчитывается более 1000.

Специальное малогабаритное оборудование разработанное Н.И. Васильевым |24}, адаптировано для проведения пробы на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента в условиях отделения переливания крови, в непо­средственной близости от постели больного.

Для производства моноклональных антител применяют метод гибридизации иммунных лимфоцитов (полученных от иммунизированных людей) с клетками мышиной миеломы или трансформации иммунных лимфоцитов вирусами. Вместо миеломных клеток мыши используют также лимфобластоидные клеточные линии человека. Гетеро- и аллогибридомы обладают способностью к самоподдержанию, присущей опухолевым клеткам, и одновременно способностью продуцировать ан­титела. Существует несколько способов гибридизации иммунных лимфоцитов:

  • прямая гибридизация, когда лимфоциты иммунизированного лица сли­вают с клетками миеломы в расчете, что среди слившихся клеток мо­гут оказаться лимфобласты, продуцирующие моноклональные антите­ла. Этот способ менее эффективен, поскольку вероятность слияния опу­холевых и антителопродуцирующих клеток очень мала;
  • реиммунизация in vitro, когда перед слиянием с миеломными клетками им­мунные лимфоциты выдерживают с эритроцитами, содержащими соответ­ствующий антиген, то есть иммунизируют их вторично. Этот прием позво­ляет повысить концентрацию лимфобластов или лимфобластоподобных клеток во взвеси иммунных лимфоцитов и таким образом увеличить веро­ятность получения требуемого гибрвда-продуцента;
  • трансформация иммунных лимфоцитов вирусом Эпштейна - Барр. Этот способ не требует использования мышиной миеломы. Эффект превраще­ния короткоживущих иммунных лимфоцитов в самоподдерживающуюся линию достигается тем, что встроившийся в геном клетки вирус придает ей способность к безудержной пролиферации.

Вирусную трансформацию лимфоцитов, придающую им опухолегенные, ма-лигнизирующие свойства, можно рассматривать как своеобразную гибридиза­цию ДНК лимфоцитов и ДНК вирусов. В результате такой гибридизации лим­фоциты или лимфобластоподобные клетки преодолевают апоптоз (управляе­мую гибель клеток) и становятся практически бессмертными#

Первые моноклональные анти-О-антитела были получены Вгоп и соавт. [184], Lowe и соавт. [450], Thompson и соавт. [652] и другими авторами [291,
402, 555]. Вскоре были получены антитела анти-С [651], анти-с [555, 651], анти-Е [651], анти-е [182, 292, 651], анти-G [290, 651], aHTH-Cw [653], анти- Rhl7, анти-Ю129 и анти-Ю146 [580,659].

Первые в России моноклональные антитела анти-D и анти-DC полу­чены в Центральном НИИ гематологии и переливания крови профессо­ром И.Л. Чертковым с сотрудниками [17,18, 31].

И.В. Дубинкиным с соавт. получены штаммы гетерогибридом человек х мышь, продуцирующие моноклональные антитела к антигенам D, с, Cw, Е и др., пригод­ные для промышленного производства диагностических реагентов [51,52,53].

Для этого лимфоциты периферической крови доноров, продуцирующих соответ­ствующие антитела, гибридизировали с клетками мышиной миеломы Х-63 и NS1.

Полученные антитела тестировали по панели стандартных эритроцитов ГНЦ РАМН (табл. 4.40). Класс иммуноглобулинов устанавливали с помощью мы­шиных моноклональных антител к иммуноглобулинам человека в реакции не­прямой иммунофлюоресценции. Титр антител определяли посредством реак­ции в солевой и коллоидной среде, а также непрямой реакции Кумбса в зависи­мости от принадлежности антител к тому или иному классу иммуноглобулинов (табл. 4.41).

Таблица 4.40

Протокол испытания моноклональных антител со стандартными эритроцитами

Эритроциты

Реагирование м продуди

оноклональных антител, эуемых штаммом

PvhD-1

RhD-2

RhD-3

RhE-1

RhE-2

RhCw-l

Rhc-1

ccddee Kk

+

ccDEE kk

+

1

+

+

+

+

CCDee kk

+

+

+

CcCwDee kk

+

+

 

+

+

DCcEe Kk

+

+

 

+

+

+

CcDEe KK

+

 

+

 

 

 

Оптимальным разводителем моноклональных антител анти-Rh, позво­лившим получать активные и специфичные тестовые реагенты, явились рас­творы с низкой ионной силой в комбинации с коллоидами полисахаридной природы. В настоящее время эти реагенты широко применяют в лечебно-профилактических учреждениях.

Характеристика моноклональных антител

Штамм

Класс Ig

Специфичность

Титр

Выраженность

зеакции в среде

солевой

коллоидной

RhD-1

IgM

Анти-D

1

16 000

++++

++++

RhD-2

IgM

Анти-D

1

1 600

+++

+++

RhD-3

IgGl

Анти-D

1

1 200

+++

RhE-1

IgM

Анти-Е

1

128

+++

++

RhE-2

IgM

Анти-Е

1

512

+++

+++

RhCw-l

IgM

Ahth-Cw

1

1 ООО

+++

+

Rhc-1

IgG3

Анти-с

1

512

+++

 

 

Для определения антигенов и антител системы резус известен целый ряд различных методов (табл. 4.39). Все методы с их многочисленными модифика­циями можно разделить на 2 большие группы: методы, включающие использо­вание тестовых сывороток с полными антителами и основанные на применении сывороток, содержащих неполные резус-антитела.

Таблица 4.39

Методы определения антигенов и антител системы резус

Реакция солевой агглютинации (Landsteiner, Wiener [408]) Конглютинационные пробы

    • на чашках Петри (Блинов Н.И., Дробышева Н.С. [21])
    • на подносах (Успенская О.В. [123])
    • в пробирках с желатином (Башлай А.Г. [14])
    • в пробирках с 33% полиглюкином (Михайлова А.А. [79])
    • с гепарином (Ашкенази А.Я. [9])
    • с композитом коллоидов (Траулько Ф.А. [109])
    • экспресс-метод на плоскости (Донсков СИ. [36]) Ферментные методы
    • с фицином (Донсков СИ. [36])
    • с протелином (Сахаров Р.С [95])
    • с трипсином (Dausset, Widal [253]) Антиглобулиновые пробы
    • непрямая проба Кумбса (Coombs, Mourant, Race [238])
    • двойной Кумбс (Зотиков Е.А. и др.)
    • Кумбс-фермент (Unger и Katz [667])
    • адсорбция - элюция (Weiner [700])
    • потребление антиглобулина

Карточки для определения групп крови (Элдон [273]) (Донсков СИ. [36])

Инструментальные методы

      • Групаматик (Франция)
      • Техникой (США)
      • Контифло (Румыния)
      • АГК-01 (Алипов А.Н. и др. [7])
      • гелевые технологии ДиаМед (Швейцария),

ОртоБайоВью (Англия), Скангель, Биорад (Франция) Медиком, GRIFOLS (Испания) Молекулярно-биологические методы

      • полимеразная цепная реакция
      • Саузерн-блот

Вторая, наиболее многочисленная, группа методов может быть подразделена на 3 подгруппы: конглютинационные, антиглобулиновые и ферментные.

В качестве самостоятельной группы следует выделить методы с использо­ванием специальных карточек с высушенными на них тестовыми реактивами. Перед исследованием высушенные реагенты растворяют каплями воды и прово­дят определение как на плоскости.

Отдельные группы составляют инструментальные методы - анализаторы групп крови, а также молекулярно-биологические технологии.

По оснащению и технике выполнения методы можно разделить на проби­рочные, капиллярные и выполняемые на плоскости.

В первые годы после открытия резус-фактора его определяли с помощью агглютинации в солевой среде, основанной на использовании сывороток, со­держащих полные антирезус-антитела. Этот метод был разработан в 1941 г.

Landsteiner и Wiener [408] и усовершенствован Boorman, Dodd и Mollison [179]. В СССР метод агглютинации в солевой среде был внедрен в Центральном ин­ституте переливания крови М.А. Умновой [113] и его применяют до настояще­го времени.

Метод отличается точностью и четкостью результатов, однако при его вы­полнении необходимо отмывать исследуемые эритроциты, готовить из них взвеси и длительно (1ч) инкубировать взвеси с сывороткой. Перечисленные ма­нипуляции требуют специального оснащения: термостата, центрифуги, микро­пробирок, что усложняет исследование и увеличивает его продолжительность.

В связи с этим усилия многих исследователей были направлены на упроще­ние этого метода. Однако многочисленные модификации метода солевой агглю­тинации, в частности капиллярные методики (Chown [215], Chown, Lewis [217, 220]), пробы с применением центрифугирования (Poole, Williams [534], Harvey [337], Majsky [455]) или выполняемые на плоскости (Wootton [723]), были по существу сведены к упрощению отдельных технических элементов. В целом же определение резус-фактора этим методом продолжает оставаться до настояще­го времени относительно сложным и продолжительным лабораторным исследо­ванием. К этому следует добавить и то обстоятельство, что сыворотки с полны­ми антителами, необходимые для метода агглютинации в солевой среде, редко встречаются и их количество ограничено. Однако с внедрением технологий по­лучения моноклональных антител это ограничение было снято.

Более перспективными оказались методы, включающие использование сы­вороток с неполными антителами. Благодаря относительной простоте и доступ­ности тестовых сывороток они нашли широкое применение как за рубежом, так и в России.

Наибольший практический интерес из этой группы методов представляют конглютинационные пробы, основанные на использовании различных коллоид­ных жидкостей, которые либо добавляют к тестовой сыворотке, либо взвешива­ют в них исследуемые эритроциты.

Первая конглютинационная проба с применением в качестве коллоидной среды плазмы крови была предложена Diamond и Abelson [262].

В СССР аналогичный метод был разработан независимо от указанных выше авторов в Ленинградском институте переливания крови Н.И. Блиновым и Н.Д. Дробышевой [21] и впоследствии усовершенствован Т.Г. Соловьевой [104]. Этот метод, получивший название - определение резус-фактора в сывороточ­ной среде на чашках Петри, основан на использовании эритроцитов, взвешен­ных в собственной сыворотке. Взвесь эритроцитов и тестовых сывороток нано­сят на чашку Петри, которую затем помещают в водяную баню при температу­ре 45-48 °С. Результат учитывают после 10-минутной инкубации взвеси по на­личию или отсутствию агглютинации эритроцитов. «Чашечный» метод прост и удобен, однако его недостатком является невозможность исследования свежей цельной крови, так как в условиях указанной температуры она свертывается.

я устранения этого недостатка E.G. Копосов [67, 68] рекомендовал ис­пользовать смесь свежей цельной крови с одногруппной стандартной изогемаг-глютинирующей сывороткой.

А.Я. Ашкенази [13] предложила другой, более удачный, прием устранения отмеченного недостатка «чашечного» метода. Автор рекомендовала добавлять в тестовую сыворотку гепарин, что позволило определять резус-фактор свежей крови, взятой непосредственно от обследуемого. Тем не менее «чашечный» ме­тод, так же как и другие конглютинационные пробы, основанные на использо­вании плазмы или сыворотки, нуждался в существенной доработке. Дело в том, что плазма и сыворотка, в которой взвешивают исследуемые эритроциты, об­ладают относительно низкой конглютинационной активностью, в силу чего аг­глютинация эритроцитов в большинстве случаев выражена недостаточно силь­но. Поиски коллоидных сред с более выраженными конглютинационными свой­ствами привели исследователей к использованию других естественных и синте­тических коллоидов.

Diamond и Denton [263] впервые отметили, что агглютинация эритроцитов выражена в значительно большой степени, если плазму, в которой они были взвешены, заменить раствором альбумина. Позднее эти данные были подтверждены, и альбумин стал широко применяться при определении резус-фактора (Р.М. Уринсон [118], Tuck [663], Stratton [633], Lawrence [414]).                                                                                                                                                                                                                                                     

Fisk и Мс Gee [286] обратили внимание на высокие конглютинационные свойства раствора желатина и предложили использовать его в качестве кол­лоидной среды при определении резус-фактора и выявлении неполных резус-антител. Впоследствии этот метод был модифицирован А.Г. Башлай [15] и до настоящего времени с успехом применяется во многих серологических лабора­ториях Российской Федерации.

О.В. Успенская [123] привела данные, свидетельствующие о том, что приме­нение раствора желатины при определении резус-фактора позволяет сократить продолжительность этого исследования.

Grubb [324], изучая конглютинационные свойства синтетического плазмоза-менителя - декстрана, показал, что титры сывороток антирезус при разведении их декстраном значительно превышают результаты титрования в изотоническом растворе натрия хлорида.

Продолжая начатые Grubb исследования, Jones [382] и Bonnel [178] устано­вили, что декстран по сравнению с изогемагглютинирующими сыворотками и альбумином также обладает более выраженными конглютинационными свой­ствами.

И.И. Забалуева [54], изучив конглютинационные свойства декстрана, указа­ла на возможность его применения в качестве стандартного разводителя, позво­ляющего увеличить ресурсы дефицитных сывороток антирезус. Кроме того, ис­пользование декстрана при определении резус-фактора значительно повысило демонстративность реакции (А.Я. Ашкенази [9], О.В. Успенская [123]).

Наряду с перечисленными коллоидами широкое применение в серологиче­ских реакциях нашел также другой синтетический плазмозаменитель - поливи-нилпирролидон, который не уступает по своим конглютинационным свойствам растворам декстрана (McNeil, Trentelman [474], Stroje и соавт. [637]).

Замена плазмы другими коллоидными разводителями позволила существен­но улучшить качество конглютинационных методов, в частности повысить чет­кость результатов исследования, сократить его продолжительность.

Дальнейшее совершенствование конглютинационных проб способствовало созданию методов, пригодных для определения резус-фактора без нагреватель­ных приборов. Интересные данные получили Eldon [273] и Drachmann [264], Они показали, что сыворотки антирезус, разведенные высокомолекулярным декстраном, приобретают способность специфически агглютинировать эритро­циты в условиях комнатной температуры.

Вслед за этим были предложены методы определения резус-фактора без подогрева с использованием альбумина (Murray [499]; Hrubisko, Hrabinska [354]; Sturgeon [640]) и гепарина (А.Я. Ашкенази [13]; Daszynski [250]). Наи­больший практический интерес представляет метод, разработанный Hrubisko и Hrabinska. При определении резус-фактора этим методом каплю тестовой сы­воротки в комбинации с альбумином наносят на предметное стекло и добавля­ют 5-10% взвесь эритроцитов в собственной сыворотке. Стекло оставляют на 10 мин при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

Таким образом, применение коллоидных растворов с более выраженным, чем у плазмы, конглютинационными свойствами позволило не только сократить продолжительность определения резус-фактора и повысить четкость результа­тов этого исследования, но и существенно упростить его.

Нами совместно с P.M. Уринсон и Е.А. Зотиковым [34, 49] был разработан экспресс-метод определения резус-фактора на плоскости без подогрева, осно­ванный на использовании сывороток антирезус в комбинации с альбумином или полиглюкином. Этот метод позволил определять одновременно резус-фактор, его разновидности и группу крови. Благодаря своей простоте и доступности он широко применялся в лечебно-профилактических учреждениях России в пери­од с 1966 г. до конца 1980-х гг., пока не уступил место еще более простым мето­дам с использованием моноклональных антител.

Также перспективным в плане разработки более совершенных методов опре­деления резус-фактора оказалось еще одно направление, а именно использова­ние в серологических реакциях протеолитических ферментов.

Первые сообщения о принципе ускорения реакции антиген - антитело с помо­щью ферментов появилось в 1946-1947 гг. (Pickles [525], Morton, Pickles [490]). Вскоре после этого различными авторами был предложен целый ряд серологиче­ских методов выявления антигенов и антител с использованием протеолитических ферментов животного, растительного и бактериального происхождения: трипсина (Morton, Pickles [489], Willert [718], Young [727]), папаина (Lov [449], Gilbey [303]),

бромелина (Pirofsky и соавт. [528], Moore и соавт. [479], Majsky [456]), протелина (Р.С. Сахаров [95]), фицина (СИ. Донсков [36]) и других ферментов.

Разработка этих методов имела большое практическое значение, так как по­зволила повысить чувствительность реакции. Более того, с помощью фермен­тов некоторым авторам удалось создать методы определения резус-фактора, не требующие нагревательных приборов (Р.С. Сахаров [95], СИ. Донсков [36]).

При определении резус-фактора методом, разработанным Hekker с соавт. [344], тестовую сыворотку, папаин, активированный солянокислым цистеином, и взвесь исследуемых эритроцитов наносят на предметное стекло и выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре. После этого стекло покачивают и учитывают результат. Morganti [488] и Esche [274] дали высокую оценку этому методу, подчеркивая его быстроту и наглядность результатов. То же самое можно сказать о методе, предложенном Tribedi, Crosbie [662] и Р.С. Сахаровым [95].

Таким образом, была показана принципиальная возможность определения резус-фактора с помощью сывороток в сочетании с высокомолекулярными кол­лоидами или протеолитическими ферментами и созданы первые методы, такие же быстрые, удобные и простые как определение группы крови.

Смешивание и разведение сывороток в практике серологических лабораторий применяют очень широко. Это делают с целью утилизировать сыворотки с отно­сительно низким титром антител, повысить их активность и специфичность, уве­личить объем серии. Кроме того, упрощается контроль серий стандартных сыво­роток, полученных из нескольких небольших порций исходного сырья.

В отношении смешивания изогемагглютинирующих сывороток мнения ав­торов расходятся. Так, В.Н. Краинская-Игнатова [72], Б.А. Вартапетов [23], Т.Г. Соловьева [102] считали, что при смешивании нескольких образцов сыво­роток конечный титр изогемагглютининов выше среднеарифметического. По данным P.M. Уринсон [118], титр смесей не повышается и равен среднеарифме­тическому.

В противоположность этому И. Мишенин и Г. Иванихенко [81] привели дан­ные о том, что титр смесей снижается и быстро падает в процессе их хранения.

А.А. Тарасевич [107] на основании своих исследований пришла к выводу, что при смешивании изогемагглютинирующих сывороток титр смеси может со­ответствовать среднеарифметическому, быть выше или ниже его.

Большинство авторов сходятся во мнении о необходимости смешивания сы­вороток антирезус и их разведения (Л.В. Буренкова [22], P.M. Уринсон [119], А.Я. Ашкенази [10], Т.М. Сафронова [94], Ф.А. Траулько [109]).

С одной стороны, это позволяет повысить их активность и титр по срав­нению с исходным, с другой - увеличить количество стандартной сыворотки (А.Я. Ашкенази [9]). Однако в этом есть свои особенности.

Многочисленные исследователи, применявшие для разведения сывороток антирезус плазму и сыворотку AB(IV), отмечают, что разные образцы плазмы и сывороток AB(IV) неодинаково активируют одну и ту же антирезусную сыво­ротку. Так, Spielmann [625] при титровании резус-антител в нескольких образ­цах изогемагглютинирующих сывороток получил разницу в титре на 4 ступени.

А.Я. Ашкенази [9,10] отметила, что титры резус-антител при разведении сыворотки антирезус разными сериями сывороток АВ могут колебаться от 1 : 4 до 1 : 1024.

Аналогичные результаты были получены также О.В. Успенской [123] и Т.Г. Соловьевой [104].

Таким образом, конглютинационные свойства сывороток-разводителей, чаще группы AB(IV), сильно колеблются.

Spielmann [625] связывает это с различной концентрацией белка в сыворот­ках. Особенно низкий титр автор получил при разведении сыворотки антирезус сывороткой больной, страдающей гипопротеинемией.

Однако вряд ли можно объяснить разницу в титре на 4-8 ступеней только разной концентрацией белка в сыворотках-разводителях. По-видимому, в этих случаях имеют место какие-то более тонкие механизмы, воздействующие на ре­акцию антиген - антитело, возможно, эндогенные ингибиторы антител.

Другая коллоидная среда - декстран - обладает более стабильными конглютинационными свойствами (ПЛ. Забалуева [54], Ф.А. Траулько [109], А.Я. Ашкенази [11], О.В. Успенская [123], А.Е. Скудицкий [1011]), поэтому его применяют вплоть до настоящего времени очень широко. Конглютинационная активность декстрана значительно выше, чем сывороток AB(IV), что позволило использовать декстран для получения большого количества тестовых сывороток антирезус их разведением (Ф.А. Траулько [109], О.В. Успенская [123], СИ. Донсков [36]).

Большим достижением в прикладной иммуносерологии явились исследо­вания Eldon [273], который установил, что сыворотки антирезус, разведенные высокомолекулярным декстраном, могут быть использованы для определения резус-фактора на плоскости при комнатной температуре. До работ Eldon имму-носерологи полагали, что резус-антитела, будучи иммунными, имеют темпера­турный оптимум реагирования 37 °С и по определению не могут реагировать при комнатной температуре, 20-22 °С

Дальнейшие исследования, проведенные в этом направлении Hrubicko, Hrabinska [354], СИ. Донсковым [36], показали, что определять резус-фактор и его разновидности можно при комнатной температуре, если в сыворотки анти­резус добавить концентрированный раствор альбумина или полиглюкина.

Аналогичные результаты были получены Daszynski [250] и А.Я. Ашкенази [И] при использовании сывороток в комбинации с гепарином. Однако, как от­мечает Daszynski, метод определения резус-фактора гепаринизированными сы­воротками не достаточно чувствителен.

Таким образом, было положено начало способам приготовления тесто­вых сывороток, пригодных для определения резус-фактора на плоскости при комнатной температуре, и появилась перспектива разработки методов, ко­торые позволяли объединить определение группы крови и резус-фактора в один процесс [36].

Первые сыворотки антирезус в России получены М.А. Умновой [113] в 1948 г. в Центральном институте переливания крови и Т.Г. Соловьевой [103, 104] в 1949 г. в Ленинградском институте переливания крови иммунизацией морских свинок и кроликов эритроцитами обезьян и человека. Однако при­менение гетероиммунных сывороток имело существенные недостатки. Во-первых, их приготовление было весьма затруднительно, поскольку связа­но с содержанием большого количества животных, их иммунизацией, заго­товкой от них сывороток и последующим удалением из сывороток гетероан-тител. Во-вторых, гетероиммунные сыворотки не позволяли дифференциро­вать более тонкие различия антигенов системы резус. Было установлено, что путем иммунизации животных эритроцитами, содержащими разновидно­сти резус-антигена I rhf (С) или rh" (Е), не удается получить сыворотки с со­ответствующими антителами. Кроме того, М.А. Умнова [114] отметила, что гетероиммунные сыворотки проявляют панагглютинационные свойства в от­ношении эритроцитов новорожденных, и поэтому определить резус-фактор в этих случаях не представляется возможным.

С 1956 г., по данным Т.Г. Соловьевой [103], в нашей стране стали широко применять изоиммунные сыворотки антирезус, которые в значительной степени лишены указанных выше недостатков. Источником их получения служат резус-отрицательные лица, перенесшие посттрансфузионные осложнения, связанные с переливанием резус-положительной крови, или резус-отрицательные женщи­ны, сенсибилизированные к резус-антигену в результате беременностей.

Однако количество тестовых сывороток, получаемых из этих источников, не удовлетворяло растущей потребности лечебных учреждений в этих диагно­стических реактивах, а также в сырье для приготовления иммуноглобулина анти-D с целью профилактики ГБН. С начала 1960-х годов в России стали при­менять искусственную иммунизацию доноров, что позволило получать высоко­активные антирезусные сыворотки в достаточном количестве (Т.Г. Соловьева, М.Б. Мамедова [105], P.M. Уринсон, СБ. Скопина [122]).

Свойства тестовых сывороток антирезус

К общим свойствам сывороток антирезус относят их специфичность, актив­ность и титр.

Свежезаготовленные нативные сыворотки крови в большинстве случаев вы­зывают неспецифическую агрегацию эритроцитов независимо от групповой и резус-принадлежности лиц, от которых они получены. В связи с этим сыворот­ки необходимо выдерживать до тех пор, пока они не утратят эту способность. Для изогемагглютинирующих сывороток этот срок варьирует в пределах 3 не­дель (P.M. Уринсон [118]); антирезусные сыворотки утрачивают панагглютина­ционные свойства в течение нескольких суток.

Для устранения панагглютинационных свойств антирезусных сывороток применяли прогревание их в термостате в течение 15-20 ч (Т.Г. Соловьева) или разведение сыворотками АВ (О.В. Успенская [123], Т.Г. Соловьева [103]).

Другое свойство сывороток антирезус - их активность (авидность), характе­ризуется скоростью появления агглютинации эритроцитов, а также величиной агглютинатов. Для изогемагглютинирующих сывороток эти показатели относи­тельно постоянны, за исключением случаев замедленной агглютинации эритро­цитов со слабым А2-антигеном.

Активность сывороток антирезус зависит от целого ряда причин: методики использования, коллоидного разводителя, степени разведения сыворотки и др.

Титр сывороток, который также является показателем их активности, должен быть не ниже 1 : 64 [61].

Однако титр и активность сывороток не всегда взаимосвязаны. А.Я. Ашкенази [9] отмечает, что некоторые сыворотки с относительно низким титром резус-антител вызывают крупную агглютинацию эритроцитов и вполне могут быть использованы в качестве стандартных. Таким образом, при 6ф боре сывороток в качестве тестовых решающим моментом является их авид-ность.

Новости медицины

Рассматривая статины?

Много миллионов человек в мире принимают статины, но исследования показывают, что только 55% из тех, кому рекомендуется принимать статины, принимают их. Это большая проблема, потому что исследования также показывают, что те из группы...

Высокое АД во время беременности может повлиять на сердце женщины в долгосрочной перспективе

Связанное с беременностью высокое кровяное давление может привести к долгосрочным сердечным рискам, показывают новые исследования.

Отмена приема опиоидов по рецепту имеет болезненные последствия для пациентов

Кэролин Консия, столкнулась с более серьезными последствиями репрессий против назначения опиоидов, когда узнала, почему сын ее подруги покончил с собой в 2017 году.

Психическое заболевание не является причиной массовых расстрелов

Новое исследование показывает, что психические заболевания не являются фактором большинства массовых расстрелов или других видов массовых убийств.




Тесты для врачей

Наши партнеры