Moore и Green [481] обнаружили, что в процессе иммунной преципитации полипептидов D и сЕ специфическими антителами одновременно с полипептидами преципитируются N-гликозилированные белки, получившие название RhAG (Rh-ассоциированные гликопротеины), или Rh-гликопротеины. Компоненты этих белков, сопровождающие полипептиды D и еС, имели несколько отличающуюся мол. массу, но одинаковую N-концевую аминокислотную последовательность [147].
Ridgwell и соавт. [565] клонировали фрагменты кДНК, соответствующие
Rh-связанному гликопротеину, и выделили кДНК полной длины из библиотеки кДНК костного мозга человека. Полученный Rh-гликопротеин содержал 409 аминокислот и имел, подобно полипептидам Rh, 12 мембранных доменов с внутриклеточными N- и С-концевыми участками. Аминокислотная последовательность Rh-гликопротеина и Rh-полипептида различалась. Сходство ограничивалось двумя аминокислотными остатками в первом и пятом домене: Glu 13 и Glu 146 - в гликопротеине Rh, Glu 21 и Glu 146 - в полипептиде Rh [565].
Структура генов RH
В 1972 г. Ruddle и соавт. [587] удалось определить, что генный локус системы резус расположен на хромосоме 1. Затем он был картирован на коротком плече хромосомы в участке 1р34.3-р36.13 [211,453,462].
Когда была получена кДНК, соответствующая Rh-полипептидам, ее можно было использовать в качестве зонда в Саузерн-блоте для исследования геномной ДНК, т. е. определения структуры генов RH.
Результаты этих исследований подтвердили, что локус RH включает 2 очень похожих гена (СЕ и £>), а один из этих генов отсутствует в гДНК, выделенной у нескольких неродственных лиц D- [233]. Таким образом была установлена молекулярная основа общего для европеоидов фенотипа Rh-, который часто обусловлен делецией гена D.
Ген D включает 10 экзонов и имеет организацию, похожую на структуру гена СЕ, но не идентичную ей (см. рис. 4.7).
Гены D и СЕ различаются по интрону 4 [138]. В гене СЕ имеется делеция 650 пар нуклеотидов, начинающаяся в интроне 4 от нуклеотида 181 [146]. Интрон 4 гена СЕ имеет 1976 пар нуклеотидов. Нуклеотиды в положении 1-181 и 831-1076 примерно идентичны в генах D и СЕ. Интрон 5 генов DnCE включает 1636 пар нуклеотидов. Имеется 29 нуклеотидных различий между этими двумя генами (98,2 % гомологии).
Организация гена СЕ исследована Cherif-Zahar и соавт. [209]. В связи с тем что антиген D обусловлен геном, отсутствующим у людей Rh-, определение молекулярной структуры антигенов Сс и Ее упростилось.
Mouro и соавт. [496] экстрагировали матричную РНК людей с редким фенотипом СсЕе и использовали синтетические олигонуклеотидные праймеры в присутствии обратной транскриптазы для получения кДНК полной длины, соответствующей продукту гена СЕ.
Присутствие антигенов Е и е было обусловлено заменой пролина на аланин в позиции 226. Пролин в этой позиции придавал субстрату специфичность Е, аланин - специфичность е (см. рис. 4.5).
При сравнении кДНК лиц, содержащих антигены С и с, ситуация ока-лась сложнее. Наблюдали 6 различий в нуклеотидах, одна часть из которых (Cysffl6, He 60, Ser 68, Sep 103) коррелировала с экспрессией С, другая (Тгр 16, Leu 60, Asn 68, Pro 103) - с экспрессией с (hr1) [496]. Эта находка была подтверждена амплификацией гДНК от людей с известным фенотипом: экзон 1 и 2 кодировал остатки, специфичные для антигенов Сс, а экзон 5 | специфичные для антигенов Ее.
Cherif-Zahar и соавт. [208] высказали предположение, что, хотя антигены Сс и Ее являются продуктами одного и того же гена и кодированы одним видом мРНК, возможен альтернативный сплайсинг, формирующий несколько белков. Полипептид полной длины кодирует экспрессию антигенов Ее, а не Сс; сплай-сеоформа, в которой отсутствует экзон 5, кодирует экспрессию Сс, но не Ее. Гипотеза подтверждается тем фактом, что из препаратов мРНК людей Rh- могут быть выделены разные продукты гена СЕ.
По мнению Umenishi и соавт. [666], сплайсеоформы не являются производными гена СЕ\ они могут также происходить от гена D. Некоторые сплайсеоформы выделены из незрелых эритробластов.
В экспериментах Smythe и соавт. [618] антигены с и Е были получены de novo на поверхности эритроидных клеток К562, в которые был введен ретро-вирус, комбинированный с кДНК, соответствующей сЕ-экспрессии. Поскольку использованная кДНК была полной длины, это отчетливо подтвердило, что антигены с и Е находятся на одном и том же полипептиде.
Аминокислотная замена, определяющая Е- и е-специфичность [Pro 226 (антиген Е), Ala 226 (антиген е)], находится в четвертой внеклеточной петле полипептида СЕ. Эта локализация полностью соответствует серологическим различиям антигенов Е и е. Однако антигенные различия обусловлены не только аминокислотной заменой, но и соответствующим молекулярным окружением. Полипептид D также имеет остаток аланина в положении 226, но не несет е-антигенности.
Структура антигенов С и с сложнее, потому что полипептиды СЕ имеют 4 аминокислоты для антигена С и 4 - для антигена с, одна из которых [Ser 103 (антиген С) или Pro 103 (антиген с)] расположена на второй внеклеточной петле полипептида.
Три из четырех аминокислот (Не 60, Ser 68, Ser 103), которые отличают С-активный полипептид от с-активного, обнаружены также в D-полипептиде. Этщ 3 аминокислоты кодируются экзоном 2 гена СЕ и экзоном 2 гена D. Не исключено, что именно благодаря этому подобию антигенов D и С антитела анти-D могут содержать анти-С-специфичность даже в тех случаях, когда эритроциты, послужившие антигенным стимулом, не имели серологически выявляемого антигена С, т. е. это был «чистый D». Во многом идентичная топология полипецтидов, кодируемых генами D и СЕ, лежит в основе перекрестных реакций антигенов и антител системы резус.
Считается, что гены RH синтезируют полипептиды, несущие Rh-антигены, не используя субстанций-предшественников.